吴道南自幼勤勉，常常读书致深夜不辍。他于万历十年(1582）乡试中举，进士及第后授编修，升左中允，进东宫为太子讲学。偶遇太子神情不专，便立即停讲，直到太子改过。历任左谕德，少詹事，又升礼部右侍郎，署部事。曾请皇上追谥建文朝忠臣。
　　京城久旱无雨，吴道南借机上疏针贬时务：“天下人情郁而不散，致成旱灾。如东宫天下本，不使讲明经术，练习政务，久置深闱，聪明隔塞，郁一也；司法悬缺半载，谳鞫无人，囹圄充满，有入无出，愁愤之气，上薄日星，郁二也；内藏山积，而闾阎半菽不充，曾不发帑振救，坐视其死亡转徙，郁三也；累臣满朝荐、卞孔时，时称循吏，因权珰构陷，一系数年，郁四也；废弃诸臣，实堪世用，一斥不复，山林终老，郁五也。陛下诚涣发德音，除此数郁，不崇朝而雨露遍天下矣。”神宗见疏仍不觉悟。
　　不久，父亲去世，吴道南归家守丧。万历四十一年（1613)九月，神宗命下，拜吴道南为礼部尚书兼东阁大学士，与方从哲一起参预机务，吴道南三辞，皇上不允，只得离家入朝就职。
　　吴道南为政襟怀坦荡，颇有声望。万历四十四年（1616)，他同礼部尚书刘楚先主考会试。吴江人沈同和，目不识丁，贿赂礼部考试官与同乡赵鸣阳联号舍。考试答题均由赵鸣阳代笔。榜发，沈同和位列第一，士子们议论纷纷。吴道南知情后，立刻下令复试，结果沈同和整整一日才勉强写出一文，沈同和与赵鸣阳均被除名，沈还被叛罪充军边疆。但仍有朝臣借机发难，必欲除去吴道南。加之前科也是吴道南主考，当时房考官汤宾尹科场隔房搜得韩敬卷，强行令总裁官萧云举、王图拔为第一，榜发，士论大哗。吴道南为知贡举官本想疏奏，因薛、王二人都是资深前辈，怕人议论排挤前辈故而未上报，没想到自己竟遭连章论劾，其中尤以给事中刘文炳、御史李嵩最甚，有些言辞几近人身攻击。吴道南实在忍无可忍，亦-言道“台谏劾阁臣，职也。未有肆口谩骂者。臣辱国已甚，请立罢黜。”神崇向来十分雅重吴道南，遂谪刘文炳外任，罚李嵩俸禄。由此造成党派之争，愈演愈烈。吴道南执意辞职，闭门不出达一年多，共上疏二十七次请归乡，神宗依旧不批准，正遇其继母辞世，吴道南才从这场纷争中脱身。
　　天启初年（1621)，吴道南进太子太保衔。天启三年（1623)病逝，赠少保，谥文恪。
　　吴道南为官二十多年，勤政清廉，不阿迎权贵，也不因官高爵显而以势凌人。他一贯行装简朴，不摆阁臣的架子。家中财产还不及中等人家。吴道南在文学创作上，颇有成就，文章典雅绵密，入情入理。
　　著有《河渠志》，编有《秘笈新书》、《别集》等。